BL21(DE3)Electroporation-CompetentCell50μl/支
pUC19(controlvector,10pg/μl):10μl
保存条件(保质期):-80℃(6个月)
基因型
F-ompThsdSB(rB-mB-)galdcm(DE3)
产品说明
BL21(DE3)为Lon蛋白酶和OmpT外膜蛋白酶缺陷菌株。λ噬菌体DE3区含有T7噬菌体RNA聚合酶,该区整合于BL21的染色体上,所以称为BL21(DE3)。BL21(DE3)菌株可同时表达T7RNA聚合酶和大肠杆菌RNA聚合酶,用于pET系列,pGEX,pMAL等质粒的蛋白表达。BL21(DE3)电击感受态细胞经特殊工艺制作,pUC19质粒检测转化效率达1×1010cfu/μgDNA,可用于各种多肽,蛋白表达文库的构建。
操作方法
1.0.1cm电击杯和杯盖从储存液中拿出倒置于干净的吸水纸上5分钟,待其沥干水分,正置5分钟,待乙醇挥发干净立即插入冰中,压实冰面,电极杯顶离冰面0.5cm以方便盖上杯盖,冰中静置5分钟充分降温。
2.取-80℃保存的BL21(DE3)电击感受态细胞插入冰中5分钟,待其融化,加入目的DNA(质粒或连接产物)并用手拨打EP管底轻轻混匀,避免产生气泡,立即插入冰中。
A.测定转化效率使用1μl10pg/μl的对照质粒pUC19;
B.对于连接产物,大部分公司的T4连接酶反应体系或50度反应重组体系可与BL21(DE3)电击感受态混合后电击转化,无需进行DNA纯化,但DNA浓度不能过高,DNA浓度不超过100ng/μl,体积不超过5μl/50μl感受态。
C.对盐浓度较高的DNA溶液或反应体系请用乙醇沉淀DNA后加入适量TE缓冲液(10mMTrisHCl,pH7.5;1mMEDTA)重悬,然后与BL21(DE3)电击感受态混合进行电击转化。
3.用200μl枪头(用刀切除0.5cm枪尖)将感受态-DNA混合物快速移到电击杯中,避免产生气泡,盖上杯盖。
4.启动电转仪,设置参数:C=25μF,PC=200Ω,V=1.8kV(此为BioRad电转仪推荐参数,也可按所用电转仪推荐的参数操作),将电击杯快速放入电转槽中,电击完成快速插入冰中。
5.2分钟后从冰中取出电击杯,放室温,加入700μl不含抗生素的无菌S.O.C.培养基(室温),用1ml枪吹吸电击杯底部数次混匀后,转移到50ml离心管(BDFalcon50ml锥形离心管等),向离心管中补加S.O.C.培养基至10ml。37℃,225rpm复苏60分钟。
6.5000rpm离心一分钟收菌,重悬后取100-200μl涂布到含相应抗生素的S.O.C平板上(因菌量较大,若全部涂板请选用直径15cm培养皿2-5个)。将平板倒置放于37℃培养箱过夜培养13-17小时。
S.O.C培养基配方
2%Tryptone
0.5%YeastExtract
10mMNaCl
2.5mMKCl
10mMMgCl2
10mMMgSO4
20mMglucose
PH-7.0
S.O.C.Mediumissuitableforuseinthefinalstepofcelltransformationtoobtain
maximaltransformationefficiencyofE.coli(Hanahan,1983).
注意事项
1.加入DNA时体积不应大于感受态体积的1/10。
2.电击感受态细胞加入电击杯应避免产生气泡,气泡会增加弧光放电风险。
3.当DNA不纯或存在盐,乙醇,蛋白及缓冲液等污染时,转化效率急剧下降。
4.电击杯里的离子可增加溶液的电导,增大在含有细胞和DNA的溶液中产生电流和弧光放电的风险。
5.若转化大质粒或想获得较高转化效率,推荐使用高纯质粒提取试剂盒提取质粒。质粒增大一倍,转化效率下降一个数量级。
6.对于连接产物转化,部分公司的连接体系或重组体系(例如:Thermo,NEB公司的T4连接酶系统,NEB,天根的50度反应重组系统)可以直接与BL21(DE3)电击感受态混合后电击转化,无需纯化,但DNA浓度不能过高,最好不超过100ng/μl。过高浓度连接产物或过大体积连接产物会降低转化效率,增加弧光放电的风险。
7.混入质粒时应轻柔操作,吸取感受态细胞时避免用力过猛,以免剪切力过大损伤细胞膜,降低转化效率。转化高浓度的质粒或连接产物可相应减少最终用于涂板的菌量。
8.电击感受态细胞最好保存在-80℃以下,高于-80℃超期储存会导致转化效率会下降。
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BL21(DE3) 电击感受态细胞